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2019年12月開(kāi)始的新型冠狀病毒肺炎（NCP）正在國(guó)內(nèi)大規(guī)模流行，成為影響全社會(huì)的公共衛(wèi)生事件。國(guó)內(nèi)的科研機(jī)構(gòu)迅速行動(dòng)，在短時(shí)間內(nèi)獲得了新型冠狀病毒（2019-nCoV）的全基因組序列。無(wú)論是從治療的角度還是從流行病學(xué)的角度來(lái)說(shuō)，對(duì)于疑似病例的診斷都有著極其重要的意義。

來(lái)自武漢和廣州的研究人員報(bào)道了他們用高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）從2名武漢大學(xué)中南醫(yī)院疑似患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中鑒定2019-nCoV的過(guò)程，并發(fā)表在了新一期的Emerging Microbes & Infections上。

事件還原：

2020年1月2日，從兩名患有非典型肺炎的患者中獲得了支氣管肺泡灌洗液（BALF）樣本。

2020年1月3日，進(jìn)行SARS特異性RT PCR檢測(cè)，產(chǎn)生部分RdRp片段，并揭示了潛在的病原體。

2020年1月4日，擴(kuò)展RdRp片段并獲得更多的基因組片段，并開(kāi)始準(zhǔn)備mNGS RNA文庫(kù)。

2020年1月5日，完成了mNGS RNA文庫(kù)的制備。

2020年1月6日，開(kāi)始在Miseq平臺(tái)上進(jìn)行mNGS測(cè)序。

2020年1月7日, 接收測(cè)序數(shù)據(jù)，啟動(dòng)病原體鑒定流程，獲得病毒基因組，確定2019-nCoV為病原體，終的CoV基因組為29,881 nt。

2020年1月8日, 進(jìn)行基因組比較和進(jìn)化分析。

自2020年1月3日起，即時(shí)進(jìn)展報(bào)告已發(fā)送到中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC），在病原體鑒定方面取得的每個(gè)進(jìn)展保持同步。

和現(xiàn)在常用的核酸檢測(cè)手段——RT-PCR相比，NGS有著不可替代的顯著優(yōu)勢(shì)。RNA-Seq可以檢測(cè)生物體內(nèi)的“感染組”，如RNA病毒、DNA病毒、細(xì)菌、真核生物等，因?yàn)槌貌《就獾牟≡w都可以表達(dá)RNA。RNA-Seq不僅可以檢測(cè)，而且還能揭示病原體豐度、變異情況、基因表達(dá)等信息。

目前，NCP病死率比較高的患者主要分為兩類(lèi)：老年人和有基礎(chǔ)病的患者。有基礎(chǔ)病的患者感染2019-nCoV之后可能會(huì)加重基礎(chǔ)病，例如繼發(fā)細(xì)菌感染，從而使病情惡化。有些患者的免疫反應(yīng)非常強(qiáng)，過(guò)激的炎癥因子風(fēng)暴非常危險(xiǎn)。上一段中提到的RNA-Seq的優(yōu)勢(shì)此時(shí)就能幫助醫(yī)療人員判斷病情，提供個(gè)性化治療。

患者1為39歲男性，患者2為21歲女性。2名患者入院后接受了進(jìn)行了影像學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，2名患者的肺部均可能發(fā)生了病毒感染。隨后的常規(guī)抗病毒和抗感染治療并未緩解其癥狀。這之后，2名患者接受了常規(guī)病原檢測(cè)，均為陰性。RT-PCR檢測(cè)顯示發(fā)現(xiàn)的病毒與SARS-Cov無(wú)關(guān)。

在常規(guī)病原檢測(cè)的同時(shí)，研究者收集了2名患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF），從中提取了總RNA，由于總RNA濃度太低，低于Qubit核酸分析儀定量0.5ng/ul的測(cè)量下限了，所以研究人員采用Nugen的Trio RNA-Seq微量樣本建庫(kù)試劑盒進(jìn)行了文庫(kù)構(gòu)建，并在MiSeq上進(jìn)行PE150測(cè)序，在24 h內(nèi)各獲取了2名患者的7.34M和4.52M reads。測(cè)序數(shù)據(jù)顯示樣本中病毒的豐度*：平均基因組覆蓋率分別為523.6X和133.7X，估計(jì)的豐度水平分別是患者1和2測(cè)序總序列的1.5％和0.62％。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，2名患者的幾乎全部病毒reads（分別為99.9%和99.7%）都屬于2019-nCoV。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，雖然數(shù)據(jù)中存在單核苷酸多態(tài)性（SNP），但2名患者所感染的是同一冠狀病毒，被分別命名為2019-nCoV毒株WHU01和WHU02。

研究者在建庫(kù)階段采用了Nugen公司的Trio RNA-Seq建庫(kù)試劑盒，Trio整合了Nugen的三項(xiàng)技術(shù)：

• AnyDeplete技術(shù)，能夠定向去除人體宿主rRNA，提高信噪比,，減少背景序列干擾。
• 單引物等溫?cái)U(kuò)增（SPIA） 技術(shù)，可以無(wú)偏倚地從有限和降解的樣品中擴(kuò)增RNA。
• DimerFree技術(shù)，使建庫(kù)過(guò)程中不產(chǎn)生引物二聚體，文庫(kù)更高效、可靠。

在這項(xiàng)研究中，相比于普通的RNA-Seq，Trio的*優(yōu)勢(shì)極大地幫助了科研人員：

由于使用AnyDeplete技術(shù)去除了人核糖體RNA（噪音），病毒reads（信號(hào)）所占比例大大提高，而且可以從轉(zhuǎn)錄水平上與宿主自身的RNA相比較。2名患者的2019-nCoV reads分別占測(cè)序總數(shù)據(jù)的1.5%和0.62%，豐度非常高，超過(guò)了表達(dá)比較高的宿主基因，是2019-nCoV正在宿主肺部活躍復(fù)制的鐵證。

呼吸道疾病患者的BALF可能比較粘稠，富含蛋白質(zhì)，而且來(lái)自2019-nCoV疑似病例的樣本要首先經(jīng)過(guò)56°C、30 min滅活，才能進(jìn)行后續(xù)的RNA提取。以上這些情況增加了RNA提取的難度，會(huì)導(dǎo)致提取到的RNA量少、質(zhì)量低。而Trio的SPIA技術(shù)可以無(wú)偏倚地從有限和降解的樣品中擴(kuò)增RNA，保證了后續(xù)建庫(kù)的成功率和轉(zhuǎn)錄豐度的保真性。

參考文獻(xiàn)：

Liangjun Chen, Weiyong Liu, Qi Zhang, Ke Xu, Guangming Ye, Weichen Wu, Ziyong Sun, Fang Liu, Kailang Wu, Bo Zhong, Yi Mei, Wenxia Zhang, Yu Chen, Yirong Li, Mang Shi, Ke Lan & Yingle Liu (2020) RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak, Emerging Microbes & Infections, 9:1, 313-319, DOI: 10.1080/22221751.2020.1725399